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蛋白质结晶技术发展的艰难历程

科学家们研究蛋白质结晶技术花费了很长时间。1988年诺贝尔化学奖被授予三位德国科学家，原因是三个人通力合作，在世界上解析了一种膜蛋白——菌光合反应中心的高分辨率三维结构，它拉开了膜蛋白结构生物学的序幕，在生物学界影响非常大。之后，科学家们在***组学和蛋白质组学领域不断取得新进展，可以作为潜在靶向的蛋白质的数量呈指数级增加，然而这些方法获得有用晶体的成功率不足20%。

2011年，英国帝国理工学院和萨里大学的科学家们使用一种“分子印迹聚合物（MIPs）”的材料，研发出了一种更有效的制造蛋白质晶体的方法。但是这种方法在结晶条件成分复杂，包含高盐，，宽泛的酸碱区间等条件下，容易造成MIPs对蛋白质的印记作用失效。科研不断深入，技术不断迭代，目前，应用为广泛的晶体制备方法当属规模筛选，比如高通量蛋白质结晶筛选，即从成百上千个溶液条件中筛选出适合结晶的条件。据相关数据显示，目前的高通量蛋白质结晶筛选的成功率仅为15.6%，严重制约了蛋白质结晶技术在结构生物学领域的应用和发展。缺乏、广谱的蛋白晶体制备技术是目前结构生物学研究中的技术瓶颈。

近期，由深圳***技术研究院喻学锋研究员课题组研发的一种蛋白质结晶筛选添加剂——人工晶种混悬液打破了技术桎梏。新法的应用，能够让蛋白质晶体的结晶更简便，更科学，更完整。

蛋白质结晶原理

蛋白质的X射线结构分析首先要获得合适的单晶。蛋白质结晶学尚未发展成熟，尽管很受人亲睐，特别是受航天飞机中微重力实验 的激发。蛋白质结晶是一个反复试验的过程，蛋白质逐渐会从溶液中析出，杂质、晶核及其他未知因素对此过程有所影响。通常，蛋白质越纯，生长晶体几率越大。蛋白质结晶学者对蛋白质的纯度要求要严于生化学家的要求，后者往往在酶催化活性足够高时就很满意。另一方面，为了使蛋白质结晶，不仅要加其他成分，所有蛋白质分子的表面性质也必须是相同的，特别是表面的电荷分布，因为它影响晶体内分子的聚集。质谱是蛋白质结晶中的一种有效工具，例如检测重组蛋白的表达、样品纯度、重原子衍生物及蛋白质结构的特性。

蛋白质结晶涉及四个重要步骤

1. 蛋白质纯度的确定。如果不够非常纯，必须要进一步纯化。

2. 蛋白质溶解于合适的溶剂中，从中它能通过一种盐或有机化合物而析出。溶剂通常是水-缓冲剂溶液，有时加，如2--2，4-（MPD）。正常情况下，沉淀剂也被加入，但是浓度不高于使沉淀产生。对于不溶于水-缓冲剂或水-的膜蛋白，还需要加入去污剂。

3. 使溶液过饱和。在这一步中，小聚集体形成，它是晶体生长所需的核。对小分子的结晶来说，相比于蛋白质更为人熟知，晶核的自发形成需要提供表面张力能。一旦这个能障被突破了，晶体开始生长。能障在高水平的过饱和度时很容易克服。因此，在高过饱和度时，晶核更易自发形成。晶核的形成可作为一个过饱和度和其他参数的函数通过多种方法来研究，包括光散射、荧光去极化及电子显微镜。

4. 一旦晶核形成，晶体生长正式开始。对低分子量的化合物而言，新分子会逐步结合到正在生长的晶体表面。这是由于这些位置的结合能比较大，相对于分子结合到平滑的表面。这些步骤要么由晶系缺陷造成，要么发生在表面随机形成的晶核。

普通蛋白结晶板

在普通24孔板的基础上发展出来用于结晶学研究。透明的PS材料，平整无变形的底提供了优异的光学性能。孔缘突出于板面，减少孔间污染的风险。在“沉滴”（Sitting Drop）中，需要用到“微桥”（Micro-Bridges）,结晶过程中或之后，“微桥”可以转移到另外一个孔。可用VIEWseal?（676070）密封，也可以用盖玻片通过硅油密封每一孔。

用于油下结晶（Microbatch）,梯形的孔形可将样品溶液集中于孔*，平的底部可在显微镜下观察结晶的生长。